它是多种疾病成像的“照妖镜”，以后是不是不用担心误诊了？

出品：科普中国

制作：中国科学院宁波材料技术与工程研究所 邢洁 吴爱国

监制：中国科学院计算机网络信息中心

生、老、病、死，是自然界的规律。虽然目前我们仍无法改变生命终将消亡的结局，但从古至今人类从未停止与衰老，疾病做斗争的脚步。而近代医学的发展，更是极大地延长了人类的平均寿命。

医学的发展，是多学科参与的结果。例如物理学中的超声波、核磁共振现象用于疾病成像；化学中的放射性元素用于疾病造影成像诊断及放疗，和大量合成的化学药物；此外，包括基因筛查等大数据时代的疾病诊断与预测更是运用了数学中的分析与统计学方法 。各种行业的人才经过共同努力、合作交流来促进医学技术的发展，才能在人类死亡宿敌面前取得先机。因此，今天我们向大家介绍一种有前景的多学科领域交叉的生物医学工具——光学成像探针。

光学成像，是以发光探针的发光强度为检测信号的可视化成像技术，主要包括生物发光技术与荧光技术两种。其中在荧光技术领域，基于荧光蛋白、以及基于荧光分子相关的超分辨荧光成像技术分别在2008年和2014年前后两次获得诺贝尔化学奖，可见荧光技术研究的重要性，实用性。 一般来说，荧光技术主要是通过荧光探针的协助，对生物体进行标记。我们可以利用荧光成像灵敏度高，无创，实时等优势，对活体生物细胞活动或基因表达等生理变化，进行可视化的成像监测。荧光探针设计及成像技术的研究发展迅猛，已经广泛的应用于生命科学、发光成像指导手术、医学研究和药物开发等领域 。

什么是荧光？

在日常生活中，人们通常把各种微弱的光都称为荧光，例如萤火虫、发光水母，夜明珠，荧光棒的光都属于广义的荧光现象。

生活中的荧光现象（图片来源：百度图片）

而严格意义上的荧光定义，一般情况下指的是当某种常温物质吸收某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）能量后，进入激发态，并且在较短时间（10-7～10 -9 s）内发射出比吸收光能量低的长波长的出射光（通常波长在可见光波段） ，具有这种性质的出射光就被称之为荧光。

由于从入射光激发到出射光发射所用时间较短（纳秒级别），因此很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象立即随之消失。 另外有一些物质在入射光撤去后仍能较长时间（10-4～10s）发光（从激发态回到基态经过较为复杂的转换过程，辐射出光子），称为磷光 。此外，还有一些物质入射光撤去后在更长时间（数个小时级别）内仍能够发光的现象，称为余辉 。该过程更为复杂，例如夜明珠具有长余辉现象。

荧光和磷光发光原理示意图（图片来源：参考文献[1]）

什么是荧光探针？

荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性地将分析对象的化学信息连续转变为分析仪器易测量的荧光信号的分子测量装置。

荧光探针受到周围环境的影响，在一定体系内，与某种物质发生化学或物理作用后，该分子的荧光信号能发生相应改变，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。利用特定的分子探针信号变化与体内组织的本征形成对比反差，从而获得影像效果，荧光成像可以在体内展示出很高的空间分辨率 。

荧光探针结构示意图（图片来源：参考文献[2]）

荧光探针分子的结构如上图所示。一般来说，荧光探针由三个主要结构元素组成：荧光团（发光物质）、连接部分，与识别部分。

首先，识别部分主要保证探针的特异性和选择性，是疾病靶向性设计中最重要的组成部分。 识别部分抗干扰性越高，信号就越准确。

其次，在荧光探针中荧光团作为信号发生部分，目前主要由无机荧光材料、有机类小分子荧光染料担任。 无机荧光材料主要有稀土类荧光材料，包括具有代表性的镧系发光元素——铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等，和发光量子点如CdSe，CdTe等。有机分子荧光材料 种类繁多，它们多结构易于调整，波长范围广泛，荧光探针常用荧光团有花菁类染料、罗丹明系列、香豆素及其衍生物、萘酰亚胺、氟硼二吡咯类以及AIE（Aggregation-Induced Emission）类荧光分子如四苯乙烯等。荧光团的激发和发射波长是探针设计中主要考虑因素。近红外（Near-infrared NIR）波长范围（700nm-1700nm）位于组织自体荧光范围之外，组织穿透深度可达5 - 10毫米。因此，几乎所有用于临床的光学成像剂都为NIR材料。 目前有许多商业上可获得的染料覆盖了NIR波长的范围，并且研究证明波长越长越有利于提高信噪比。

最后，连接部分是连接识别部分与荧光团的桥梁，一般是碳链或者化学键。 连接体可控制探针的整体大小，从而影响探针的整体性能如体内扩散速率、细胞渗透性和血浆循环时间等。

荧光探针的响应机理

（1） 光诱导电子转移机理（PET, photo-induced electron transfer）

在识别基团未与分析物结合之前，荧光团受光激发后激发态的电子不能跃迁到基态，使得荧光基团的荧光淬灭。而识别基团与被分析物结合后，PET过程受阻，荧光基团的荧光得以恢复。简而言之，就是探针与分析物质结合之前，探针不发光，结合后具有强烈荧光，因此我们可以根据荧光强度等参数从而分析判断被分析物。

（2） 分子内电荷转移机理（ICT, intramolecular charge transfer）

分子内电荷转移荧光的探针分子，通常是荧光团上同时连有推电子基团（电子给体，donor）和吸电子基团（电子受体，acceptor）,通过大π键提供电子转移的通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，该部分的推拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结构重新分布，从而导致吸收光谱、发射光谱发生变化，主要是光谱红移或蓝移。因此这种探针主要根据光谱形状改变分析，来判断被分析物。

（3） 荧光共振能量转移机理（FRET, fluorescence resonance energy transfer）

荧光共振能量转移指的是一个荧光体系含有两个荧光团，一个充当能量供体donor，另一个为能量受体acceptor。 当用供体的激发去激发荧光体系时，能够发生从donor到acceptor的非辐射能量转移，从而发射出受体荧光团的荧光。这种类型的荧光种探针分析物质时，主要是依据受体荧光团荧光变化。

荧光探针在生物医学中的应用

现在我们清楚了荧光探针发生信号变化的原理，那么它是如何运用到疾病成像诊断中的呢? 道理很简单，荧光探针能够针对多种分析物做出响应，那么当这些被分析物是各种疾病指标时，荧光随疾病指标而动，从而对相关疾病做出成像和诊断 。

用于动物模型的光学探针的实例：非侵入性癌症诊断、体内和离体外科指导（图片来源：参考文献[2]）

如图4所示，生物体注射靶向肿瘤微环境的探针后仅在靶向部位有信号响应，用于肿瘤检测诊断，制定合理的手术方案 （小鼠乳腺癌模型活体成像）（组图A）；荧光探针可依据肿瘤的异质性选用肿瘤相关特殊靶点（例如蛋白酶，pH，能量代谢异常等），在手术中有效分辨肿瘤边界，用于术中导航 ，做到既不残留病灶，又能够减少正常组织被切除带来的痛苦（引导切除犬的肿瘤组织）（组图B）；此外，荧光探针还可以辅助组织切除后直观诊断病情发展状况 ，发光部分为异常组织（诊断为浸润性导管癌）（组图C）。

此外还有许多疾病模型的荧光探针研究，例如炎症模型（肝炎，关节炎）、阿尔茨海默症、糖尿病等 。

炎症模型荧光成像示意图（图片来源：参考文献[3]）

阿尔茨海默症荧光成像示意图（图片来源：参考文献[4]）

相比于传统疾病检测技术，荧光成像方法具有高选择性、高分辨率、实时，创伤小，减轻患者诊断痛苦等优势。 国家自然科学基金在荧光成像技术领域给予极大的支持，仅2017年荧光探针相关项目就达68项之多，可见其是一种极具前途的成像策略。

目前，相关领域的研究热点主要集中在提高成像深度及信噪比方面 ，最近许多科研工作者在国际顶级期刊就近红外长波长范围（＞1000nm）成像发表了研究成果。

参考文献：

[1]分子发光分析荧光磷光—石河子大学药学院.

[2]M. Garland, J. J. Yim, M. Bogyo, Cell Chem. Biol. 2016, 23, 122.

[3]Q. Y. Gong, R. F. Zou, J. Xing, L. C. Xiang, R. S. Zhang, A. G. Wu, Adv Sci 2018, 5.

[4]J. Yang, X. Zhang, P. Yuan, J. Yang, Y. Xu, J. Grutzendler, Y. Shao, A. Moore, C. Ran, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2017, 114, 12384.

（本文中标明来源的图片均已获得授权）

FIB常见应用明细及原理分析

FIB常见应用明细及原理分析

系统及原理

双束聚焦离子束系统可以简单理解为单束聚焦离子束系统与普通SEM的耦合。单束聚焦离子束系统由离子源、离子光学柱、束描画系统、信号采集系统和样品台5部分构成。离子束镜筒的顶端是离子源，在离子源上加较强的电场来抽取出带正电荷的离子，这些离子通过静电透镜及偏转装置的聚焦和偏转来实现对样品的可控扫描。样品加工是通过将加速的离子轰击样品使其表面原子发生溅射来实现，同时产生的二次电子和二次离子被相应的探测器收集并用于成像。

常见的双束设备是电子束垂直安装，离子束与电子束成一定夹角安装，如图所示。通常称电子束和离子束焦平面的交点为共心高度位置。在使用过程中样品处于共心高度的位置即可同时实现电子束成像和离子束加工，并可以通过样品台的倾转使样品表面与电子束或离子束垂直。

典型的离子束显微镜包括液态金属离子源及离子引出极、预聚焦极、聚焦极所用的高压电源、电对中、消像散电子透镜、扫描线圈、二次粒子检测器、可移动的样品基座、真空系统、抗振动和磁场的装置、电路控制板和电脑等硬件设备，如图所示：

外加电场于液态金属离子源，可使液态镓形成细小尖端，再加上负电场牵引尖端的镓，而导出镓离子束。在一般工作电压下，尖端电流密度约为10-4A/cm2，以电透镜聚焦，经过可变孔径光阑，决定离子束的大小，再经过二次聚焦以很小的束斑轰击样品表面，利用物理碰撞来达到切割的目的，离子束到达样品表面的束斑直径可达到7纳米。

设备部分应用

1 TEM制样

2 截面分析

3 芯片修补与线路修改

4 微纳结构制备

5 三维重构分析

6 原子探针样品制备

7 离子注入

8 光刻掩膜版修复

常用的TEM制样

1、半导体薄膜材料

此类样品多为在平整的衬底上生长的薄膜材料，多数为多层膜（每层为不同材料），极少数为单层材料。多数的厚度范围是几纳米-几百纳米。制备样品是选用的位置较多，无固定局限。

2、半导体器件材料

此类样品多为在平整的衬底上生长的有各种形状材料，表面有图形，制样范围有局限。

3、金属材料

金属材料，多为表面平整样品，也有断口等不规则样品，减薄的区域多为大面积。

4、电池材料

电池材料多为粉末，每个大颗粒会有许多小颗粒组成，形状多为球形，由于电池材料元素的原子序数较小，pt原子进入在TEM下会较为明显，建议保护层采用C保护。

5、二维材料

此类样品为单层或多层结构，如石墨烯等，电子束产生的热效应会对其造成损伤，在制备样品前需要在表面进行蒸镀碳的处理，或者提前在表面镀上保护膜。

6、地质、陶瓷材料

此类样品导电性能差、有些会出现空洞，制备样品前需要进行喷金处理，材料较硬，制备时间长。

7、原位芯片

用原位芯片代替铜网，将提取出来的样品固定在芯片上，进行减薄。

截面分析

利用FIB的溅射刻蚀功能可以对样品进行定点切割，观察其横截面（cross-section）表征截面形貌尺寸，同时可以配备结合元素分析（EDS）系统等，对截面成分进行分析。一般用于芯片、LED等失效分析领域，一般IC芯片加工过程中出现问题，通过FIB可以快速定点的进行分析缺陷原因，改善工艺流程，FIB系统已经成为现代集成电路工艺线上不可缺少的设备。

芯片修补与线路编辑

在IC设计中，需要对成型的集成电路的设计更改进行验证、优化和调试。当发现问题后，需要将这些缺陷部位进行修复。目前的集成电路制程不断缩小。线路层数也在不断增加。运用FIB的溅射功能，可将某一处的连线断开，或利用其沉积功能，可将某处原来不相连的部分连接起来，从而改变电路连线走向，可查找、诊断电路的错误，且可直接在芯片上修正这些错误，降低研发成本，加速研发进程，因为其省去了原形制备和掩模变更的时间和费用。

微纳结构制备

FIB系统无需掩膜版，可以直接刻出或者在GIS系统下沉积出所需图形，利用FIB系统已经可以制备微纳米尺度的复杂的功能性结构，包括纳米量子电子器件，亚波长光学结构，表面等离激元器件，光子晶体结构等。通过合理的方法不仅可以实现二维平面图形结构，甚至可以实现复杂三维结构图形的制备。

三维重构分析

使用FIB对材料进行三维重构的3D成像分析也是近年来增长速度飞快的领域。此方法多用于材料科学、地质学、生命科学等学科。三维重构分析目的主要是依靠软件控制FIB逐层切割和SEM成像交替进行，最后通过软件进行三维重构。FIB三维重构技术与EDS有效结合使得研究人员能够在三维空间对材料的结构形貌以及成分等信息进行表征；和EBSD结合可对多晶体材料进行空间状态下的结构、取向、晶粒形貌、大小、分布等信息进行表征

原子探针样品制备

原子探针( AP) 可以用来做三维成像( Atom Probe Tomography，APT) ，也可以定量分析样品在纳米尺度下的化学成分。要实现这一应用的一个重要条件就是要制备一个大高宽比、锐利的探针，针尖的尺寸要控制在100 nm 左右。对原子探针样品的制备要求与TEM 薄片样品很接近方法也类似。首先选取感兴趣的取样位置，在两边挖V 型槽，将底部切开后，再用纳米机械手将样品取出。转移到固定样品支座上，用Pt 焊接并从大块样品切断。连续从外到内切除外围部分形成尖锐的针尖。最后将样品用离子束低电压进行最终抛光，消除非晶层，和离子注入较多的区域。

离子注入

离子束注入改性研究也是FIB加工的一个基础性研究课题。例如采用高能离子束轰击单晶硅表面，当注入量充分的时候，离子轰击将在样品表层引入空位、非晶化等离子轰击损伤。在此过程中注入离子与材料内部有序排列的Si 原子发生碰撞并产生能量传递，使得原本呈有序排列的Si 原子无序化，在表面下形成一层非晶层。注入的离子在碰撞过程中失去能量，最终停留在距离表面一定深度的区域。

光刻掩膜版修复

在普通光学光刻中，掩膜版是图形的起源，但是经过长时间使用，掩膜版上的图形会出现损伤，造成光刻后的图形缺陷，掩膜版造价高，如果因为掩膜版上一个小的图形缺陷造成整个掩膜版的失效，重新制备掩膜版，成本高。利用FIB系统可以定点修复掩膜版的缺陷，方法简单，操作简单迅速。在透光区域的缺陷修复可以使用离子沉积，选择沉积C作为掩膜版的修复材料；在遮光区域的缺陷修复使用离子溅射，刻蚀掉遮光缺陷。不过使用FIB修复掩膜版最大的问题是会造成Ga离子污染，改变玻璃透光率造成残余缺陷，这点可以用RIE结合清洗的方法将有Ga离子注入的表层玻璃刻蚀去除，恢复玻璃透光率。

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